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PCR溫度梯度功能介紹

更新時(shí)間:2025-03-27      點(diǎn)擊次數(shù):68

PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))?是一種在體外擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)。其基本原理是模擬DNA的自然復(fù)制過程,在體外利用DNA聚合酶實(shí)現(xiàn)DNA的快速擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系包括:

  • ?模板?:待擴(kuò)增的核酸片段。

  • ?引物?:人工合成的寡核苷酸,用于啟動(dòng)DNA合成。

  • ?dNTPs?:四種脫氧單核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。

  • ?DNA聚合酶?:如Taq酶,在高溫下保持活性,催化反應(yīng)的完成

  • ?Mg2?:穩(wěn)定DNA聚合酶的活性。


PCR反應(yīng)原理
PCR的基本原理是基于DNA的變性、退火和延伸三個(gè)步驟的循環(huán)過程:

  1. ?變性?通過加熱使雙鏈DNA解開成為兩條單鏈,溫度通常在95℃左右。

  2. ?退火?降低溫度至55-70℃,使引物與單鏈DNA模板上的互補(bǔ)序列結(jié)合。

  3. ?延伸?:在適宜的溫度下72℃左右,DNA聚合酶以引物為起點(diǎn),合成新的DNA鏈。

這三個(gè)步驟構(gòu)成一個(gè)循環(huán),每完成一個(gè)循環(huán),DNA的數(shù)量就會(huì)翻倍。經(jīng)過多次循環(huán),可以獲得大量的目標(biāo)DNA片段?。

建立一個(gè)成熟穩(wěn)定的PCR反應(yīng)所需要的條件:
完整且純凈的模板(膠圖和nanodrop測(cè)值評(píng)價(jià))
高特異高品質(zhì)的引物(引物設(shè)計(jì)軟件評(píng)分)
組分搭配適宜的反應(yīng)體系(比如針對(duì)模板的GC比,是否考慮添加DMSO或甜菜堿;高保真或高得率應(yīng)添加多少鎂離子)
合理的擴(kuò)增反應(yīng)程序(在引物Tm值附近進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)摸索最佳退火溫度)

確定合理的擴(kuò)增反應(yīng)程序與PCR儀直接相關(guān)。如果PCR儀具備溫度梯度功能,則可以通過設(shè)置不同的溫度梯度來降低實(shí)驗(yàn)次數(shù),快速確定退火溫度。

柏恒梯度PCR儀(RePure系列)具備多種溫度梯度功能,助力您的PCR實(shí)驗(yàn):
常規(guī)梯度:單向的首尾兩端設(shè)定退火溫度范圍的低值和高值,中間孔位則漸進(jìn)分布溫度,但首尾之間的孔位不一定呈現(xiàn)等差溫度分布。

線性梯度:單向的中間設(shè)定一個(gè)溫度,再設(shè)定一個(gè)相鄰孔位的溫差,設(shè)定溫度會(huì)按照溫差向兩邊擴(kuò)散。相鄰孔位的溫度嚴(yán)格按照溫差生成,可驗(yàn)證所感興趣的整數(shù)溫度??v向生成4個(gè)(8孔),橫向生成6個(gè)(12孔)。國產(chǎn)品牌只有柏恒具備此功能。
線性梯度優(yōu)勢(shì):同時(shí)進(jìn)行多個(gè)不同退火溫度的PCR反應(yīng),一次實(shí)驗(yàn)就能確定體系的退火溫度,縮短驗(yàn)證周期提高實(shí)驗(yàn)效率。

二維梯度:反應(yīng)模塊的縱向、橫向可以同時(shí)設(shè)置常規(guī)/線性梯度。使反應(yīng)模塊形成一個(gè)變性/退火均在不同溫度下反應(yīng)的陣列,通過一次反應(yīng)摸索出最佳的變性/退火溫度組合。
二維梯度優(yōu)勢(shì):1) 提高PCR反應(yīng)的特異性在二維梯度溫度下,引物與模板結(jié)合能力的變化,可以使反應(yīng)具有更高的特異性并減少非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)生。(2) 提高PCR反應(yīng)的產(chǎn)物純度通過對(duì)反應(yīng)中各分子靶點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化,以使放大的DNA產(chǎn)物得到放大。(3) 檢測(cè)基因點(diǎn)突變根據(jù)已知的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊铮ㄟ^PCR擴(kuò)增得到目標(biāo)基因的片段,然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,檢測(cè)突變位點(diǎn)。(4) 檢測(cè)種群間的遺傳多樣性通過二維梯度PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn),比對(duì)種群間的遺傳物質(zhì)多樣性。(5) 操作簡(jiǎn)單二維梯度PCR僅僅需要配置一個(gè)反應(yīng)體系即可。(6) 提高陽性檢測(cè)準(zhǔn)確性二維梯度PCR一次性就可得到96種溫度組合,大大減免了樣品簡(jiǎn)單的交叉污染,降低了假陽性出現(xiàn)的幾率,進(jìn)而提高了真陽性的檢測(cè)準(zhǔn)確性。(7) 縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間由于二維梯度PCR可以根據(jù)溫度的不同,優(yōu)化出最佳反應(yīng)溫度,縮短了多次探索變性溫度或者退火溫度的時(shí)間。

獨(dú)立6溫區(qū):相鄰溫區(qū)可設(shè)置溫差不超過5℃的溫度同時(shí)進(jìn)行退火溫度的摸索,每個(gè)溫度分區(qū)下有16孔可作為復(fù)孔位。獨(dú)立的6個(gè)溫度分區(qū)可以按照等差設(shè)置溫度也可根據(jù)需要靈活設(shè)置每個(gè)分區(qū)的溫度。相當(dāng)于線性梯度的升級(jí)版。

同時(shí),柏恒梯度PCR儀均采用前進(jìn)風(fēng)后出風(fēng)的散熱模式,即便多臺(tái)PCR儀并排放置或在臺(tái)架上密集擺放,也不會(huì)因旁邊儀器的散熱風(fēng)影響控溫的準(zhǔn)確性。


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